基因编辑:上帝的手术刀,将为我们带来怎样的技术与市场机遇? ...

2019-9-20 10:58| 发布者: 得宝宝优生顾问| 查看: 98| 评论: 0|来自: 基因谷

摘要:   一、基因编辑行业概述  1.1基因编辑的定义  基因编辑(gene editing),又称基因组编辑(genome edting)或基因组工程(genome engineering),是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰 ...
  一、基因编辑行业概述

  1.1基因编辑的定义

  基因编辑(gene editing),又称基因组编辑(genome edting)或基因组工程(genome engineering),是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。

  基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行定点“编辑”,实现对特定DNA片段的修饰。

  基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶,也称“上帝的手术刀”,在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB),诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB,因为这个修复过程容易出错,从而导致靶向突变。

  1.2基因编辑的基本原理

  对于基因功能缺失的遗传病的治疗,最根本的办法是把出错的基因找出来并进行纠正,使其恢复到正常的状态,为此科学家又发明了基因编辑技术。从微观角度看,基因编辑的过程可分为三个步骤:定位、切除、修补。


  定位异常基因:基因编辑的第一步也是最重要的一步就是在DNA上找到需要进行编辑的位置。人类基因组DNA的大小在3Gb左右,在如此庞大的基因组中准确找到几个甚至一个出错的碱基是非常困难的,因此需要一套精准的定位系统来快速锁定剪切的部位。

  切除异常基因片段:定位到目标位置以后,需要把错误的基因片段切除,这个过程主要通过内切酶来实现。目前科学家已经发现了许多种类的内切酶,也从中找到了适用于基因编辑的内切酶,如Fok I。

  修补恢复成正常基因:内切酶把错误的基因片段切除后,会在DNA上形成一段缺口,只需要把对应的正确基因片段插入到这个缺口中并与原DNA进行连接即可完成DNA的修复。这个过程原本非常复杂,但细胞偏偏自带这种功能。为了维持自身DNA的稳定,在几十亿年的生物进化过程中细胞进化出了一套“DNA修复系统”,科学家则巧妙地利用生物体自带的“DNA修复系统”实现了这个“修补”过程。简单地说,人体细胞的DNA是双拷贝的,当一条DNA出现异常时,这套修复系统会以另一条同源DNA为模板,对错误的DNA进行修复。当人为地把外源DNA(含需要插入的基因)导入细胞时,DNA修复系统会误以为该外源DNA是自身同源DNA,并以此为模板对剪切后的DNA进行修复,从而实现目的基因的插入。

  二、基因编辑工具

  在整个基因编辑过程中,“准确定位”是最困难的,也是目前所有的基因编辑技术最核心的差异所在;“剪切”已经成功实现;“修补”的过程虽然复杂,但借助于细胞自带的DNA修复系统也基本上解决了这个问题,所以难度也不大。因此,基因编辑技术只需要完成“定位”和“剪切”这两个步骤就行了。经过几十年的发展,目前的基因编辑技术主要可分为锌指核酸酶技术(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶技术(TALEN)、成簇规律性间隔的短回文重复序列技术(CRISPR)三大类。

  2.1锌指核酸酶技术(ZFN):开基因编辑先河,但是存在操作难度和专利垄断等问题。

  锌指核酸酶技术(ZFN)诞生于1996年,由细胞内天然存在的具有准确识别和结合特定DNA序列功能的转录因子衍生而来。一个锌指核酸酶由DNA识别域和DNA剪切域两部分组成。

  ZFN技术是第一代基因组编辑技术,其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun等首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys2-His2锌指模块,到1996年,Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年,Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24bp的特异性序列,由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。ZFN由锌指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸内切酶组成。其中,由ZFP构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合,而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能,两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是,细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰,而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变,因此达到基因敲除的目的。

  锌指蛋白基因编辑原理

  资料来源::Nature Reviews Genetics

  与转基因的基因治疗方法相比,ZFN的主要优势在于基因修复方式多样、精准更换基因、对基因表达强度影响较小。但是,ZFN的劣势主要有设计/筛选过程复杂、“可编辑性”仍然较低、存在脱靶风险、细胞毒性较大等。除了技术上的问题,ZFN发展面临更大的问题是专利上的封锁。

  2.2首个真正意义上的基因“可编辑”工具

  转录激活样效应因子核酸酶技术(TALEN)发明于2011年,由AvrBs3蛋白衍生而来。TALEN的工作原理与ZFN类似,核心元件的结构也类似,均由DNA识别域和DNA剪切域组成。转录激活样效应因子核酸酶通过DNA识别域结合到特定的DNA序列上,再由Fok I核酸内切酶构成的DNA剪切域对靶基因进行剪切,最后利用细胞自带的DNA修复系统完成基因编辑。TALEN与ZFN的区别在于DNA识别域对DNA序列的识别模式。在ZFN中,每个锌指蛋白识别一个DNA三碱基序列;在TALEN中,每2个氨基酸组合对应着一个特定的碱基。因此,通过人为的删减、添加和自由组合不同的氨基酸组合,科学家可以轻而易举地构造出结合特定DNA序列的蛋白,从而实现转录激活样效应因子核酸酶在人类基因组DNA上的精确定位。

  TALEN系统基因编辑原理


  资料来源:Nature Reviews Molecular Cell Biology

  与ZFN相比,TALEN在多个方面表现出明显的优势:工具蛋白设计更简便、可编辑性高、成本降低、细胞毒性降低。相对于ZFN,TALEN尽管已经有了明显的进步,也解决了ZFN一直存在的核心难题,但还有一些缺陷:(1)TALEN的工具蛋白不能通用,针对不同的基因仍需要设计特定的转录激活样效应因子核酸酶;(2)脱靶效应导致的潜在安全风险;(3)技术使用成本仍然偏高。

  2.3 CRISPR:“基因瑞士军刀”

  成簇规律性间隔的短回文重复序列技术(CRISPR)于2012年由麻省理工大学的华人科学家张峰和加州大学伯克利分校的珍妮弗独立发明。CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列,是生命进化历史上细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器,简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌,利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务,细菌为了将病毒的外来入侵基因清除,进化出CRISPR-Cas9系统,利用这个系统,细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除,这是细菌特有的免疫系统。

  细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能,其中比较典型的模式是依靠一个复合物,该复合物能在一段RNA指导下,定向寻找目标DNA序列,然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂,其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术,并先后对多种目标细胞DNA进行切除。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统,迅速成为生命科学最热门的技术。该技术具有非常精准、廉价、易于使用,并且非常强大的特点。

  CRISPR/Cas9系统基因编辑原理


  资料来源:www.cambridge.org

  与ZFN和TALEN相比,CRISPR系统的优势主要体现在系统设计简便、可实现多基因编辑等。以CRISPR/Cas9为例,发挥DNA剪切功能的Cas9元件是通用的,因此只需要根据靶基因的不同设计相应的gRNA即可,其设计难度和复杂度远低于ZFN和TALEN,大大拓展了CRISPR系统的应用前景。此外,CRISPR还具有基因编辑效率更高、操作成本低等多方面的优势。然而,CRISPR技术出现时间还太短,科学家还无法充分预估其潜在风险。相比CRISPR技术,TALEN的脱靶效应更低,更加稳定。

  基因编辑技术参数对比

  数据来源:火石创造

  三、基因编辑的行业现状:基因编辑潜力巨大

  3.1基因编辑的行业市场规模

  对于基于基因编辑技术的基因治疗来说,关键的技术难点主要是:(1)基因编辑技术,特别是CRISPR技术面世的时间还太短,存在太多不确定的因素,再加上科学家对人类基因功能和调控网络的认知还不足,轻易改动基因可能引发无法预见的安全问题;(2)基因编辑系统导入细胞的效率和基因编辑的效率都还不高,尚无法真正实现临床上的大规模应用;(3)基因编辑系统与病毒载体一样也不具有细胞靶向性。

  ZFN技术由于专利垄断的原因,全球目前仅Sangamo一家公司重点发展;采用TALEN技术的代表公司主要是Cellectis、Editas Medicine等;以CRISPR为技术手段的基因治疗公司主要是CRISPR技术的发明人张峰创立的Editas Medicine、Beam Therapeutics、Sherlock Biosciences以及珍妮弗创立的Caribou Biosciences、Mammoth Biosciences和Intellia Therapeutics。(拓展阅读:市场抢占|Mammoth Biosciences有望率先实现CRISPR商业化)

  根据美国MarketsandMarkets咨询公司发布的基因组编辑/改造市场分析报告显示,全球基因组编辑市场(包括CRISPR、TALEN和ZFN)的规模将从2017年的31.9亿美元增长到2022年的62.8亿美元,复合年均增长率高达14.5%。据MarketsandMarkets分析,推动这一市场增长的关键因素是政府资助在增长,基因组学项目也在增加。全球传染病和癌症高发,推动了研究活动。同时,人们也将这一技术应用于农作物的改造。2017年,CRISPR有望占据全球市场的最大份额。这要归因于CRISPR技术能够实现多重编辑,也就是平行利用多个向导RNA来靶定同一细胞中的多个位点,轻松实现多个基因突变,对基因组区域进行精确改造。

  根据麦姆斯咨询的研究报告显示,在治疗应用获得额外增长前,生物技术、农业技术和诊断领域的CRISPR市场规模将从2017年的5.46亿美元,增长到2023年50亿美元。这一增长将主要受到生物技术和农业技术领域的应用推动,其中在生物技术领域,CRISPR将用于预测药物发现的模型,而农业技术领域将利用CRISPR打造创新工具。诊断和治疗应用市场贡献还较小,因为该技术尚处于起步阶段,需要经过多次迭代才能优化其功效、安全性和特异性。基于CRISPR的基因编辑为基因操纵提供了终极工具,可实现各种不同的产品,以及许多正在研究和创建的新应用。

  2017--2023年CRISPR技术全球市场预测

  中国作为全球第一个将CRISPR用于人体试验的国家,迄今至少有86名中国患者接受了基因编辑治疗。相对而言,美国监管更严,需要通过种种风险评估与安全检查,在尽可能保证患者安全的前提下,才能实施基因编辑治疗。毫无疑问,中国将成为美国基因编辑技术的强劲对手。

  从当前商业化应用的情况来看,基因编辑技术主要用于科研和制药两大领域,上游的终端用户包括生物技术和制药公司、学术研究机构以及CRO等。产业链下游的应用尚处于临床试验或临床前研发阶段,产值规模受到多种因素的限制。

  据不完全统计,中国涉及基因编辑的企业有20多家,大多数以技术支持和服务外包为主,客户来源医疗机构、企业、科研院所与高校等,可见基因编辑技术本身在国内发展较为成熟,接受度较高。

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